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相信很多人都會(huì)有這樣的感受,Elisa實(shí)驗(yàn)我明明很用心很認(rèn)真的按照文獻(xiàn)或說(shuō)明書(shū)做的,為什么結(jié)果卻與文獻(xiàn)上的數(shù)據(jù)差距很大呢？經(jīng)過(guò)技術(shù)老師多年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),總結(jié)出了以下三點(diǎn)原因：試劑因素,樣本因素,操作中的因素.
一 試劑因素
1. 試劑應(yīng)選擇操作步驟簡(jiǎn)單方便,靈敏度高 特異性好 穩(wěn)定性好 批間差異小的試劑.
2. 不同廠家的試劑一定不能混用,包括底物 洗滌液和顯色劑.因?yàn)槊總(gè)廠家校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)不同,還有抗體 檢測(cè)方法 試劑 交叉反應(yīng)等因素都會(huì)導(dǎo)致對(duì)樣本的檢測(cè)結(jié)果不一致.
3. 要注意試劑的批號(hào)和出廠日期,試劑的有效期一般為6個(gè)月,實(shí)驗(yàn)時(shí)最好使用新鮮的,生產(chǎn)日期比較新的.
4. 避免選擇質(zhì)量低劣,假的 ELISA 試劑盒.有些廠家為夸大生產(chǎn) ELISA 試劑盒的指標(biāo)范圍,用一種在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中都有廣泛表達(dá)的指標(biāo)來(lái)冒充其它指標(biāo),造成各種種屬 各種指標(biāo)都可以做的假象.其實(shí)這種指標(biāo)種屬間的氨基酸序列同源性達(dá) 100%,這種指標(biāo)隨著其他因子的影響,其表達(dá)水平也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化,使得實(shí)驗(yàn)者難以查覺(jué).
二 標(biāo)本因素和操作因素
血清是最常用的 ELISA 標(biāo)本,血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本,標(biāo)本引起的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致,分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種.
1 內(nèi)源性干擾因素：包括類(lèi)風(fēng)濕因子 補(bǔ)體 高濃度的非特異免疫球蛋白 異嗜性抗體 某些自身抗體等.
類(lèi)風(fēng)濕因子在類(lèi)風(fēng)濕患者及正常人血清中,常含有較高或不同濃度的類(lèi)風(fēng)濕因子(RF),其一般為IgM型,亦有IgG和IgA型,具有與變性IgG產(chǎn)生非特異結(jié)合的特點(diǎn),因?yàn)樵?span lang="EN-US">ELISA測(cè)定中,其可與固相上包被的特異抗體IgG以及隨后加入的酶標(biāo)的特異抗體IgG結(jié)合,從而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果.避免其發(fā)生的方法有：①用F(ab)2替代完整的IgG.②標(biāo)本用聯(lián)有熱變性IgG的固相吸附劑處理.③檢測(cè)抗原時(shí),可用2-巰基乙醇加入到標(biāo)本稀釋液中使RF降解.
補(bǔ)體在固相酶免疫測(cè)定中,來(lái)自哺乳動(dòng)物的固相抗體和酶標(biāo)二抗均有激活人補(bǔ)體系統(tǒng)的功能.一方面,固相抗體和酶標(biāo)二抗可因其吸附及結(jié)合過(guò)程中抗體分子發(fā)生變構(gòu),使Fc段的補(bǔ)體C1q結(jié)合點(diǎn)暴露出來(lái),使C1q成為一個(gè)中介物將二者交聯(lián)起來(lái)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果.另一方面,固相抗體也會(huì)因?yàn)榛罨a(bǔ)體的結(jié)合,封閉抗體和抗原的表位結(jié)合能力而引起假陰性.解決的辦法是：①用EDTA稀釋標(biāo)本.②56℃ 30 min加熱血清使C1q滅活.
2 外源性干擾因素：包括標(biāo)本溶血 標(biāo)本被細(xì)菌污染 標(biāo)本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和標(biāo)本凝固不全等.
標(biāo)本的溶血血紅蛋白中含鐵血紅素有類(lèi)過(guò)氧化物酶的活性,因此,在以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)為標(biāo)志的ELISA測(cè)定中,如血清樣本中血紅蛋白濃度較高,則很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相,從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色.所以在采血時(shí)應(yīng)注意手法,采集的血液勿用力振蕩,嚴(yán)防標(biāo)本溶血.
標(biāo)本的污染菌體可能含有內(nèi)源性辣根過(guò)氧化物酶,可使實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)非特異性顯色.因此,ELISA檢測(cè)宜采集新鮮標(biāo)本,如不能當(dāng)時(shí)測(cè)定,5 d之內(nèi)應(yīng)4℃保存,1周后檢測(cè)應(yīng)低溫凍存；同時(shí),收集標(biāo)本采用無(wú)菌試管,可防止標(biāo)本的污染.
標(biāo)本的保存標(biāo)本在冰箱中保存過(guò)久,血清中IgG可聚合成多聚體,AFP可形成二聚體,在用間接法測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深,甚至造成假陽(yáng)性. 冰凍保存的標(biāo)本反復(fù)凍融產(chǎn)生機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子有破壞作用,可引起假陰性結(jié)果.因此,ELISA檢測(cè)盡量采用新鮮標(biāo)本,長(zhǎng)時(shí)凍存的樣本避免反復(fù)融凍.
標(biāo)本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纖維蛋白原,可使結(jié)果呈假陽(yáng)性.解決的方法有：①于采血管中加入適當(dāng)?shù)目鼓齽；②將采集后的血液放在架子上再放?span lang="EN-US">37℃水浴中1 h,待充分凝固后再離心分離血清.
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