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ELISA具有特異性強 靈敏度高 操作簡單等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的測定,為生物科研起到了積極的推動作用.但ELISA測定中影響因素較多,操作過程中每個環(huán)節(jié)都會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響,甚至出現(xiàn)錯誤的結(jié)果.下面主要看一下操作中因素的影響.
操作中的因素
加樣：孵育前加樣時間過長,酶試劑加出孔外,使用滴瓶滴加試劑時,滴加的角度不同和擠壓的力度不同,致使滴加的試劑量不準(zhǔn),都可導(dǎo)致試驗結(jié)果不準(zhǔn)確.控制方法：①實驗樣本過多時,可分批次操作,以減少實驗時間延長造成的誤差；②加酶試劑后,用吸水紙吸干孔外試劑；③作定量試驗時,使用加樣器加注試劑,并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性,此外,要做到一份樣本一個移液頭,防止交叉污染.
溫育：溫育是ELISA測定最為關(guān)鍵 最容易出現(xiàn)問題的步驟.最為常見的溫育溫度有37℃和室溫,其次是43℃和2-8℃.目前國內(nèi)售ELISA試劑盒溫育時間為37℃,30 min-1 h,進口ELISA試劑盒則通常為37℃,1-2 h能有較完全的結(jié)合.
溫育時間 溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說明書選擇溫育的時間 溫度.加完樣本和（或）試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時,孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需要一定時間,如果是將微孔板一放入溫箱即開始計時,這樣就容易造成實際測定中溫育時間不夠,易致弱陽性標(biāo)本測不出來.控制方法：①如有兩種溫度,盡量使用較低的溫育溫度 較長反應(yīng)時間的條件；②用1個小溫度計放置在板孔反應(yīng)液中測量觀察.
“邊緣效應(yīng)”的排除“邊緣效應(yīng)”是在使用96孔板的ELISA測定中,外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象.產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的,因此在溫育時盡量采用水浴.
洗板：ELISA測定的洗板一般有兩種方式,即手工和洗板機洗板.采用手工洗板,孔與孔之間液體易交叉,采用半自動洗板機時,洗液量不足導(dǎo)致洗板不徹底,洗板針堵塞導(dǎo)致抽吸不完全,洗板不暢導(dǎo)致清洗效果差.控制方法：①手工洗板時,拍板時要垂直,避免交叉污染,用力不能過猛,防止抗原抗體復(fù)合物脫離；②洗板機洗板時應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢,若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出；③為了洗滌效果好,實驗室可采用機器與人工洗滌相結(jié)合的方法,在機器洗滌后再進行人工洗板1-2次,或適當(dāng)增加洗板的次數(shù),有資料報道洗板7次能達到理想的洗滌效果.
顯色：市售ELISA試劑盒中,如以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物,則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以鄰苯二胺(OPD)為底物,則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑.顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15-30 min.以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑,要臨用前30 min配制且必須避光.以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光,但A B液應(yīng)盡量避免接觸金屬器械.
結(jié)果判定：讀取結(jié)果要在15-30 min內(nèi)完成,定性測定用肉眼判讀試驗結(jié)果時,反應(yīng)板應(yīng)水平距離白色背景10-15 cm；定量測定時用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果,酶標(biāo)儀不應(yīng)置于陽光或強光照射下,需先預(yù)熱15-30 min再進行測試.
綜上所述,盡管ELISA法操作簡單,但可能影響測定結(jié)果的因素也較多.故在實際操作的過程中,要加強質(zhì)量管理,認(rèn)真避免或減少影響因素,力求結(jié)果準(zhǔn)確,為科研實驗提供可靠的依據(jù).
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